求助免疫螢光pi染核問題,求助免疫螢光PI染核問題

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細胞試驗指南上dapi染核是在孵育完二抗之後，估計pi也可以在這時加。在論壇中查到的濃度不一，有10-50μm，有5ug~20ug/ml,作用時間有5-30min不等，染完後pbs洗3遍，封片。用535 nm激發波長，615 nm發射波長觀察細胞。

具體用哪一種合適估計得自己試了。

求教關於免疫螢光的問題

2樓：南京金益柏生物科技****

首先你應該確認老鼠是不是轉基因老鼠，會不會有自發螢光的產生。其次，二抗就是螢光染料，只要加了二抗，就會有螢光的產生，所以需要在加完二抗後用pbs洗5次，充分將多餘二抗洗掉，避免在拍片時產生躁點影響實驗結果。還有，確認二抗的種屬與封閉液中的某血清是否為同一類，不是同一類也會產生躁點的。

最後，是否為拍片是雷射強度過大，尤其是第二種產生的綠色螢光均為躁點啊

求助免疫螢光的結果分析

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可以用image－pro plus分析灰度

細胞免疫螢光，求助

4樓：南京金益柏生物科技****

細胞爬片免疫螢光實驗步驟

第一天：

1. 在培養板中將已爬好細胞的玻片用pbs浸洗3次，每次3min；

2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， pbs浸洗玻片3次，每次3min；

3. 0.5%triton x-100( pbs配製 )室溫通透20min（細胞膜上表達的抗原省略此步驟）；

4. pbs浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸乾pbs，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30min；

5. 吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗並放入溼盒，4℃孵育過夜；

第二天：

6. 加螢光二抗： pbst 浸洗爬片3次，每次3min，吸水紙吸乾爬片上多餘液體後滴加稀釋好的螢光二抗，溼盒中20-37℃孵育1h，pbst浸洗切片3次，每次3min；

注意：從加螢光二抗起，後面所有操作步驟都盡量在較暗處進行。

7. 復染核：滴加dapi避光孵育5min，對標本進行染核，pbst 5min×4次洗去多餘的dapi；

8. 用吸水紙吸乾爬片上的液體，用含抗螢光淬滅劑的封片液封片，然後在螢光顯微鏡下觀察採集影象。