1樓:匿名使用者
說明沒擴出
來唄建議
1.增加actin等參照管做對照。actin表達比內較保守且表達量高,均可以擴出來容。如果擴不出來說明你rna有問題,重新抽提
2.如果參照沒問題,和你的引物分別一起擴,配一樣的體系,如果你的引物還擴不出來,換用好點的酶試下
3.如果還出不來,重新設計引物吧
2樓:匿名使用者
說明你的rna降解,導致沒有合成你需要擴增的cdna。或者是你的引物設計有問題。
3樓:匿名使用者
1.rna降解
2.逆轉錄體系有問題
3.引物設計有問題
4.體系沒有優化好
你可以從這四個方面找找問題!
4樓:花鼓囊
我最近實驗也出現了這個問題,我覺得是引物出問題了,我現在在重設引物,你也摸索下試試吧。
rt-pcr和pcr引物設計為什麼會有不同
5樓:南京金益柏生物科技****
rt-pcr的核心還是pcr,模板是cdna,只不過這個cdna是rna反轉錄來的~~~ncbi上給的是cdna的序列
rt-pcr產物電泳結果只有引物二聚體,沒有目的條帶,更換引物了也這樣,求高手解答原因啊!高分
6樓:匿名使用者
1. 樓上說的都很有道來理。不同的taq確實效果源很不bai一樣。
在我所使用du過的幾十種酶中,發現凡是遇到zhi困難的dao模板,qiagen 的hotstart master mix plus一般都可以得到產物,所以我強烈推薦(可以試試配合q solution一起使用,一般免費索取)
2. 另外就是,你的目標基因的表達量是不是很低?你的pcr目的是什麼?
建議先找乙個表達豐度高的體系,驗證一下你的引物是否工作。對於極低表達豐度的目標,一輪pcr很有可能得不到產物,這是建議使用nested pcr,就是設計2套巢狀的引物,第一輪先用外面的那對,理論上可以得到乙個比較大的產物(跑膠不一定能看到),然後稀釋pcr產物50倍,再用裡面那對引物擴一次,一般可以得到跑膠看得見的產物量。
3. 關於引物設計,推薦使用primer3 plus,這是免費的網上設計軟體,很好用。比你用的那2種引用次數多很多。你google一下就可以了。
7樓:紫電
個人覺得
抄mix質量一般,mix一般是襲用來做檢測用的,比如說提取出來了質粒做轉殖鑑定啊,或者是轉基因動物做基因型鑑定用的。你要用cdna做模板的話,建議用專門的pcr的酶,這樣也可以改體系中的不同組分,比如說可以把mg離子濃度提高一些。
我建議你改用好一些的taq酶去pcr試試,比如說la taq,primer star或者pfu什麼的,保真度高。另外,你也可以試試把退火溫度再降低一下,你的退火溫度是在引物的tm值附近的嗎?
8樓:匿名使用者
不要用mix試試吧!
用taq dna buffer、dntps、mg2+、引物、taqdna聚合酶試試。
退火溫度在40到70度間都試試。可能是退火溫度已經太低了所以出現雜帶。
為什麼rt-pcr總做不出來。引物不對?
9樓:林
pcr引物的設計原則:
1 引物應用核酸系列保守區內設計並具有特異性。
2 產物不能形成二級結構。
3 引物長度一般在15~30鹼基之間。
4 g+c含量在40%~60%之間。
5 鹼基要隨機分布。
6 引物自身不能有連續4個鹼基的互補。
7 引物之間不能有連續4個鹼基的互補。
8 引物5′端可以修飾。
9 引物3′端不可修飾。
10 引物3′端要避開密碼子的第3位。
10樓:匿名使用者
這個基因表達豐度太低也是有可能的。不一定是cdna質量的原因。內參基因的表達量都是很高的,一般只要cdna質量沒問題就都能擴出來。
你應該看看這個基因在哪個組織有特異的高表達,提該組織的rna進行反轉錄,這樣比較容易擴出來。
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