1樓：曉星後衛隊
這屬於專業問題啦 下面的簡單方案是clhen等(1972)所用方法的變通方案，常用於成批製備感受態細菌，這些細菌可使每微克螺旋質粒dna產生5x106-2x107 個轉化菌落，這樣的轉化效率足以滿足所有在質粒中進行的常規轉殖的需要。該方法完全適用於大多數大腸桿菌菌株，並且比方案i快速，重複性更好。該法製備的感受態細胞可貯存於-70℃，但儲存時間過長會使轉化效率在一定程度上受到影響。
1、從於37℃培養16-20小時的新鮮平板中挑取乙個單菌落(直徑2-3mm)，轉到乙個含有100ml lb或sob培養基的1l燒瓶中。於37℃劇烈振搖培養約3小時(旋轉搖床，300轉/分)。為得到有效轉化，活細胞數不應超過108細胞/ml，可每隔 20-30分種測量od600值來監測培養物的生長情況。
在菌株與菌株之間，od600值和每毫公升中活細胞數間的關係變化很大，因此有必要通過測量特定大腸桿菌菌株的生長增減物在生長週期的不同時相的od600值，並將各濃度的增減物鋪於無抗生素的lb瓊脂平皿以計算每一時相的活細胞數，從而使分光光度讀數得到標化。 2、在無菌條件下將細菌轉移到乙個無菌、一次性使用的、用冰預冷的50ml聚丙烯管(falcon 2070)中，在冰上放置10分鐘，使培養物冷卻至0℃。切記：
下述所有步驟均需無菌操作。 3、於4℃用sorvall gs3轉頭(或與其相當的轉頭)以4000轉/分離心10分鐘，以**細胞。 4、倒出培養液，將管倒置1分鐘以使最後殘留的痕量培養液流盡。
5、以10ml用冰預冷的0.1mol/l cacl2重懸每份沉澱，放置於冰浴上。我們發現將1mol/l cacl2貯存液用純水(mille-q級或與其相當的級別)配製以10ml小份貯存於-20℃煞是方便。
製備感受態細胞時，取一小份融化，用純水稀釋至100ml，用nalgene濾器(0.45μm孔徑)過濾除菌，然後驟冷到0℃即可。對於大多數大腸肝菌菌株(除mc1061外)，在這一步採用tfb代替氯化鈣可得到相同的或更好的結果。
6、於4℃以4000轉/分離心10分鐘，以**細胞。 7、倒出培養液，將管倒置1分鐘以使最後殘留的痕量培養液流盡。 8、每50ml初始培養物用2ml用冰預冷的0.
1mol/l cacl2[或tfb，見步驟5，注]重懸每份細胞沉澱。此時，可將細胞分成小份，放於-70℃凍存。在這些條件下，儘管長期儲存後轉化效率會稍有下降，但細胞仍可保持處於感受態。
dagert和ehrlich(1979)曾表明細胞可以於4℃在cacl2溶液中儲存24-48小時，在貯存的最初12-24小時內，轉化效率增加3-5倍，然後降低到初始水平。 9、用冷卻的無菌吸頭從每種感受態細胞懸液中各取200μl轉移到無菌的微量離心管中，每管加dna(體積∞10μl，dna∞50ng)，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30分鐘。 10、將管放到預加溫到42℃的迴圈水浴中放好的試管回上，恰恰放置90秒，不要搖動試管。
11、快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1-2分鐘。 12、每管加800μl soc培養基。用水溶將培養基加溫至37℃，然後將管轉移到37℃搖床上，溫育45分鐘細菌復甦，並且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。
如果要求更高的轉化效率，在復甦期中，應溫和地搖動細胞(轉速不超過225轉/分)。 13、將適當體積(每個90mm平板可達200μl)已轉化的感受態細胞轉移到含20mmol/l mgso4和相應抗生素的sob瓊脂培養基上。如培養物體積太小(〈10μl)。
可再加肉湯培養基，用一無菌的彎頭玻棒輕輕地將轉化的細胞塗到瓊脂平板表面。如在乙個90mm平板上鋪200μl以上的感受態細胞，應離心濃縮細胞，然後用適量soc輕輕重懸細胞。如用四環素抗性作為選擇標記，全部的轉化混合物可以鋪在乙個單獨的平皿上(或鋪在軟瓊脂中)。
然而如選用氨苄青黴素抗性，則只能將一部分培養物(根據實驗決定)鋪在單獨的平皿上。氨苄青黴素抗性功的增加與平皿上所加細菌數的增加並無線性比例關係，這可能是因為被抗生素殺死的細胞可釋放生長掏物質的緣故。 14、將平板置於室溫直至液體被吸收。
15、倒置平皿，於37℃培養，12-16小時後可出現菌落。如檢查氨苄青黴素抗性，用轉化細胞鋪增板時密度較低(每個90mm平板不超過104菌落)，於37℃培養平板時不應超過20小時。氨苄青黴素抗性的轉化可將β-內醯胺酶分泌到培養基中，迅速滅活菌落周圍區域中的抗生素。
這樣，鋪平板時密度太高或培養時間太長都會導致出現對氨苄青黴素敏感的衛星菌落。在選擇培養基中不用氨苄青黴素而改用羧苄青黴素，以及將抗生素濃度從60μg/ml增至100μg/ml，可使情況有所改善，但不能徹底**之。
用氯化鈣怎樣製備新鮮的大腸桿菌感受態細胞？
2樓：筆袋dc梞
這屬於專業問題啦 下面的簡單方案是clhen等(1972)所用方法的變通方案，常用於成批製備感受態細菌，這些細菌可使每微克螺旋質粒dna產生5x106-2x107 個轉化菌落，這樣的轉化效率足以滿足所有在質粒中進行的常規轉殖的需要。該方法完全適用於大多數大腸桿菌菌株，並且比方案i快速，重複性更好。該法製備的感受態細胞可貯存於-70℃，但儲存時間過長會使轉化效率在一定程度上受到影響。
1、從於37℃培養16-20小時的新鮮平板中挑取乙個單菌落(直徑2-3mm)，轉到乙個含有100ml lb或sob培養基的1l燒瓶中。於37℃劇烈振搖培養約3小時(旋轉搖床，300轉/分)。為得到有效轉化，活細胞數不應超過108細胞/ml，可每隔 20-30分種測量od600值來監測培養物的生長情況。
在菌株與菌株之間，od600值和每毫公升中活細胞數間的關係變化很大，因此有必要通過測量特定大腸桿菌菌株的生長增減物在生長週期的不同時相的od600值，並將各濃度的增減物鋪於無抗生素的lb瓊脂平皿以計算每一時相的活細胞數，從而使分光光度讀數得到標化。 2、在無菌條件下將細菌轉移到乙個無菌、一次性使用的、用冰預冷的50ml聚丙烯管(falcon 2070)中，在冰上放置10分鐘，使培養物冷卻至0℃。切記：
下述所有步驟均需無菌操作。 3、於4℃用sorvall gs3轉頭(或與其相當的轉頭)以4000轉/分離心10分鐘，以**細胞。 4、倒出培養液，將管倒置1分鐘以使最後殘留的痕量培養液流盡。
5、以10ml用冰預冷的0.1mol/l cacl2重懸每份沉澱，放置於冰浴上。我們發現將1mol/l cacl2貯存液用純水(mille-q級或與其相當的級別)配製以10ml小份貯存於-20℃煞是方便。
製備感受態細胞時，取一小份融化，用純水稀釋至100ml，用nalgene濾器(0.45μm孔徑)過濾除菌，然後驟冷到0℃即可。對於大多數大腸肝菌菌株(除mc1061外)，在這一步採用tfb代替氯化鈣可得到相同的或更好的結果。
6、於4℃以4000轉/分離心10分鐘，以**細胞。 7、倒出培養液，將管倒置1分鐘以使最後殘留的痕量培養液流盡。 8、每50ml初始培養物用2ml用冰預冷的0.
1mol/l cacl2[或tfb，見步驟5，注]重懸每份細胞沉澱。此時，可將細胞分成小份，放於-70℃凍存。在這些條件下，儘管長期儲存後轉化效率會稍有下降，但細胞仍可保持處於感受態。
dagert和ehrlich(1979)曾表明細胞可以於4℃在cacl2溶液中儲存24-48小時，在貯存的最初12-24小時內，轉化效率增加3-5倍，然後降低到初始水平。 9、用冷卻的無菌吸頭從每種感受態細胞懸液中各取200μl轉移到無菌的微量離心管中，每管加dna(體積∞10μl，dna∞50ng)，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30分鐘。 10、將管放到預加溫到42℃的迴圈水浴中放好的試管回上，恰恰放置90秒，不要搖動試管。
11、快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1-2分鐘。 12、每管加800μl soc培養基。用水溶將培養基加溫至37℃，然後將管轉移到37℃搖床上，溫育45分鐘細菌復甦，並且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。
如果要求更高的轉化效率，在復甦期中，應溫和地搖動細胞(轉速不超過225轉/分)。 13、將適當體積(每個90mm平板可達200μl)已轉化的感受態細胞轉移到含20mmol/l mgso4和相應抗生素的sob瓊脂培養基上。如培養物體積太小(〈10μl)。
可再加肉湯培養基，用一無菌的彎頭玻棒輕輕地將轉化的細胞塗到瓊脂平板表面。如在乙個90mm平板上鋪200μl以上的感受態細胞，應離心濃縮細胞，然後用適量soc輕輕重懸細胞。如用四環素抗性作為選擇標記，全部的轉化混合物可以鋪在乙個單獨的平皿上(或鋪在軟瓊脂中)。
然而如選用氨苄青黴素抗性，則只能將一部分培養物(根據實驗決定)鋪在單獨的平皿上。氨苄青黴素抗性功的增加與平皿上所加細菌數的增加並無線性比例關係，這可能是因為被抗生素殺死的細胞可釋放生長掏物質的緣故。 14、將平板置於室溫直至液體被吸收。
15、倒置平皿，於37℃培養，12-16小時後可出現菌落。如檢查氨苄青黴素抗性，用轉化細胞鋪增板時密度較低(每個90mm平板不超過104菌落)，於37℃培養平板時不應超過20小時。氨苄青黴素抗性的轉化可將β-內醯胺酶分泌到培養基中，迅速滅活菌落周圍區域中的抗生素。
這樣，鋪平板時密度太高或培養時間太長都會導致出現對氨苄青黴素敏感的衛星菌落。在選擇培養基中不用氨苄青黴素而改用羧苄青黴素，以及將抗生素濃度從60μg/ml增至100μg/ml，可使情況有所改善，但不能徹底**之。
大腸桿菌感受態細胞製備為什麼要用cacl2處理細菌
3樓：阿魯巴星人
ca離子沉聚在細胞膜表面會使得細胞膜呈一種液晶的狀態，這種狀態便於在熱激條件下形成縫隙，便於轉化質粒。
如何除去氯化鈣中的氯化鈉，怎樣去除鹼法氯化鈣生產中的氯化鈉？
哪有樓上想得那麼複雜，氯化鈣溶解度高 室溫74.5 氯化鈉溶解度 室溫35.8 採用濃縮結晶，過濾出氯化鈉。加入過量的碳酸鈉 充分反映後 產生大量沉澱 進行過濾 收集在濾紙上的固體 加入稀鹽酸 充分反映使無固體再加入碳酸鈣 過濾濾液即為所得 將固體混合物溶於水，我們分析 鈉離子用現有知識沒法出去，所...
碳酸鈣中混有少量氯化鈣如何去除,怎樣去除氯化鈣中混有的少量碳酸鈣？
溶解加水過濾，碳酸鈣不溶於水而氯化鈣可溶。加水溶解 過濾 烘乾濾渣即得純淨碳酸鈣 用水溶解氯化鈣，過濾剩下的就是碳酸鈣 溶解之後過濾蒸發得碳酸鈣 溶解，過濾就可以了 碳酸鈣不溶，氯化鈣可以溶解 加適量碳酸銀 cacl2 ag2co3 caco3 2agcl 如還有問題請追問 謝謝 向溶液中滴加h2s...
為什麼氯化鈣的熔點高於氯化鉀？按理說，鉀的金屬性比鈣的強，與
判斷物質熔沸點高低先看晶體型別。1 若晶形不同，則原子晶體大於離子晶體大於分子晶體 金屬晶體熔沸點差別大，有特別高的如鎢，也有特別低的如汞，故和三者的比較不能有固定的規律，一般要具體分析 2 若晶形相同，則比較晶體內部離子間相互作用的強弱，相互作用越強，熔沸點就越高。1 離子晶體看離子鍵的強弱，一般...