1樓：阿魯巴星人
轉速低了離不下來，轉速高了到時候重選在轉化液裡很麻煩，所以要選取乙個合適的值。
話說一半不用rpm來算，因為不同的離心機，力矩不一樣，不同轉速會有不同的離心力。所以一般用g，一般是1500~3000g都可以的。
大腸桿菌感受態細胞製備為什麼要用cacl2處理細菌
2樓：阿魯巴星人
ca離子沉聚在細胞膜表面會使得細胞膜呈一種液晶的狀態，這種狀態便於在熱激條件下形成縫隙，便於轉化質粒。
如何製備大腸桿菌感受態細胞
3樓：匿名使用者
大腸桿菌感受態細胞的製備和轉化
準備：一. 材料
e. coli dh5α菌株: rˉ,mˉ,ampˉ；pbs質粒dna: 購買或實驗室自製，eppendorf管。
二. 裝置
恆溫搖床,電熱恆溫培養箱,台式高速離心機,無菌工作台,低溫冰箱, 恆溫水浴鍋, 製冰機, 分光光度計,微量移液槍。
三. 試劑
1.lb固體和液體培養基
2.amp母液
3.含amp的lb固體培養基:將配好的lb固體培養基高壓滅菌後冷卻至60℃左右,加入amp儲存液,使終濃度為50ug/ml,搖勻後鋪板。
4.麥康凱培養基(maconkey agar):取52g麥康凱瓊脂,加蒸餾水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高壓滅菌，待冷至60℃左右加入amp儲存液使終濃度為50ug/ml,然後搖勻後塗板。
5.0.05mol/l cacl2溶液:稱取0.28g cacl2(無水,分析純),溶於50ml重蒸水中,定容至100ml,高壓滅菌。
6.含15%甘油的0.05mol/l cacl2: 稱取0.28g cacl2(無水,分析純),溶於50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌。
操作步驟：
一、 受體菌的培養
從lb平板上挑取新活化的e. coli dh5α單菌落,接種於3-5ml lb液體培養基中,37℃下振盪培養12小時左右,直至對數生長後期。將該菌懸液以1:
100-1:50的比例接種於100ml lb液體培養基中,37℃振盪培養2-3小時至od600 ＝0.5左右。
二、 感受態細胞的製備 ( cacl2 法)
1、將培養液轉入離心管中,冰上放置10分鐘,然後於4℃下3000g離心10分鐘。
2、 棄去上清,用預冷的0.05mol/l的cacl2 溶液10ml輕輕懸浮細胞,冰上放置15-30分鐘後,4℃下3000g離心10分鐘。
3、棄去上清,加入4ml預冷含15%甘油的0.05mol/l的cacl2 溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態細胞懸液。
4、 感受態細胞分裝成200μl的小份,貯存於-70℃可儲存半年。
三、 轉化
1、從-70℃冰箱中取200μl感受態細胞懸液,室溫下使其解凍,解凍後立即置冰上。
2、 加入pbs質粒dna溶液(含量不超過50ng,體積不超過10μl),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘後。
3、42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘,熱擊後迅速置於冰上冷卻3-5分鐘。
4、向管中加入1ml lb液體培養基(不含amp),混勻後37℃振盪培養1小時,使細菌恢復正常生長狀態,並表達質粒編碼的抗生素抗性基因(ampr )。
5、將上述菌液搖勻後取100μl 塗佈於含amp的篩選平板上,正面向上放置半小時,待菌液完全被培養基吸收後倒置培養皿,37℃培養16-24小時。
同時做兩個對照:
對照組1: 以同體積的無菌雙蒸水代替dna溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的lb平板上應沒有菌落出現。
對照組2: 以同體積的無菌雙蒸水代替dna溶液,但塗板時只取5μl 菌液塗佈於不含抗生素的lb平板上，此組正常情況下應產生大量菌落。
四、 計算轉化率
統計每個培養皿中的菌落數。
轉化後在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉化子，根據此皿中的菌落數可計算出轉化子總數和轉化頻率，公式如下：
轉化子總數＝菌落數×稀釋倍數×轉化反應原液總體積／塗板菌液體積
轉化頻率**化子數／每mg質粒dna）＝轉化子總數／質粒dna加入量(mg)
感受態細胞總數＝對照組2菌落數×稀釋倍數×菌液總體積／塗板菌液體積
感受態細胞轉化效率＝轉化子總數／感受態細胞總數
[注意] 本實驗方法也適用於其它e.coli受體菌株的不同的質粒dna的轉化。但它們的轉化效率並不一定一樣。
有的轉化效率高，需將轉化液進行多梯度稀釋塗板才能得到單菌落平板,而有的轉化效率低,塗板時必須將菌液濃縮(如離心),才能較準確的計算轉化率。
製作大腸桿菌感受態細胞時，最後儲存細胞時用甘油好呢？還是用dmso好呢
4樓：匿名使用者
甘油就可以了，dmso是用來保護細胞這種比較嬌嫩的，大腸桿菌就用便宜一點的好了。
希望能夠幫到你~有問題一起討論解決哦~
5樓：匿名使用者
感受態細胞一般都是用甘油就可以了，放在-80冰箱半年內都有效
6樓：匿名使用者
我建議用甘油，但是還要看你個人了
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