1樓：冰鋒
冰浴是為了質粒附著在菌體表面,熱擊是開啟通道讓質粒進入,覺得lz的做法影響不大,不過要實際驗證
大腸桿菌感受態細胞轉化實驗中冰浴的作用是什麼?
2樓：匿名使用者
冰浴過程中，原來加在溶液中的鈣離子和細菌細胞膜結合，在低溫下形成液晶結構，這樣，在42度熱激下，這種液晶結構收縮，將細胞膜扯開孔道，使dna進入細菌細胞中。這就是原理。 前面冰浴不清楚，熱激我認為是讓已經有孔的大腸桿菌孔膨脹，增加dna進入的機率，然後立刻冰浴，使孔收縮，進去的dna不要出來。
個人想法，沒看到過類似文獻。
你在ncbi上查查第乙個利用大腸桿菌轉化的人，他是怎麼做的。文獻裡肯定有原理說明，不過可能是幾十年前的文獻了。
3樓：匿名使用者
前面冰浴不清楚，熱激我認為是讓已經有孔的大腸桿菌孔膨脹，增加dna進入的機率，然後立刻冰浴，使孔收縮，進去的dna不要出來。個人想法，沒看到過類似文獻。
你在ncbi上查查第乙個利用大腸桿菌轉化的人，他是怎麼做的。文獻裡肯定有原理說明，不過可能是幾十年前的文獻了。
4樓：浙大阿公尺巴
提高轉化率。
具體原理我不知道。
感受態細胞轉化時，熱擊後需冷卻5分鐘的原因或者好處是什麼及原理？
5樓：阿魯巴星人
化轉時，感受態細胞膜由於吸附陽離子（ca2+等）呈液晶狀態，受到熱激後，細胞膜出現裂隙，外源dna進入細胞，此時細胞非常脆弱，將其冰浴冷卻，細胞膜修復閉合，進行下一步的復甦時細胞存活率將提高。
感受態細胞的製備時有什麼注意事項
6樓：置嚼勒眯
方法一：細菌轉化的方法多以mendel和higa（1970）的發現為基礎，其基本方法是用冰預冷的cacl2或多種2價陽離子等處理細菌，使之進入感受態得以轉化。用cacl2製備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態細胞，常用於成批製備感受態細菌。
本法適用於大多數大腸桿菌菌株，且迅速、重複性好。操作過程簡述如下。1．從37℃培養16～20h的新鮮平板中挑取乙個單菌落（如大腸桿菌dh52），或1ml新鮮的16～20h過夜培養物，轉到乙個含有100mllb培養基的1l或500ml燒瓶中。
於37℃劇烈振搖培養約2～3h（旋轉搖床200～300r/min），每隔20～30min測量od600值≈0.4。2．在無菌條件下將細菌轉移到乙個，用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10～20min。
3．於4℃用sorvallgs2轉頭（或與其離心管相配的轉頭）以4000r/min離心10min，以**細胞。4．倒數培養液，將管倒置1min以使最後殘留的痕量培養液流盡。5．以10ml用冰預冷的0.
1mmcacl2重懸每份沉澱，放於冰上。6．於4℃用sorvallgs3轉頭（或與其相應的轉頭）以4000r/min離心10min，以**細胞。7．倒出培養液，將管倒置1min以使最後殘留的痕量培養液流盡。
8．每50ml初始培養物用2ml冰預冷的0.1mcacl2重懸每份沉定，此時，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存備用。9．用冷卻的無菌吸頭從每種感受態細胞懸液中各取200μl轉移到無菌的微量離心管中，每管加dna或連線反應混合物（體積≤10μl，dna≤50ng），輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30min。
10．將離心管放到預加溫到40℃的迴圈水浴中的試管架上，放置90s～2min，不要搖動試管。11．快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1～2min。12．每離心管加800μlsoc培養基，用水浴將培養基加溫到37℃，然後將管轉移到37℃搖床上，溫育45min使細菌復甦，並且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。
13．將適當體積（每個90mm平板可達200μl）已轉化的感受態細胞轉移到含200mmol/lmgso4和相應抗生素的sob培養基上。14．將平板置於室溫至液體被吸收。15．倒置平皿，於37℃培養，12～16h後可出現菌落。
方法二：cassuperone-step***petentcellprepskit採用一種簡單便捷的方法處理大腸桿菌，使其成為感受態細胞，便於質粒dna的轉化，可滿足一般實驗的要求。與cacl2法相比具有多種優點：
使用方便，只需一步即可完成感受態細胞的製備；轉化效率略高於cacl2法，一般可達106-108cfu/μg，滿足一般實驗需要；感受態細胞製成後即可儲存於-70℃,無須加入甘油，並且經長期儲存活力無明顯下降。準備工作：1．從液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌凍存菌，在lb平板上劃線，37度過夜至長出單菌落。
挑形態飽滿的單菌落2個，分別接種5mllb培養基中，37℃，250rpm，過夜培養。2．次日從5mllb培養物吸取200μl轉入50mllb培養基中（250ml錐形瓶），37℃，250rpm培養2小時，此時od600約0.4—0.
5。感受態細胞的製備：3．吸取1ml菌液到1.
5ml離心管裡，5000rpm離心5分鐘，棄去上清。4．加入100μl預冷的solutiona，懸浮菌體，冰浴30分鐘。5．此時感受態細胞已經製成可立即使用或-70℃儲存。
細胞轉化：6．在感受態細胞中加入100pg-10ngdna，混勻，冰浴30分鐘，然後42℃1分鐘熱擊，再次冰浴2分鐘。加入0.
9mllb培養基，20μlsolutionb，37℃，振盪培養1小時。7．取適當菌液（100-200μl）塗佈相應抗性的平板。8．過夜培養約16個小時，數菌落數，計算轉化率。
補充說明：1．所用器具一定要清潔；2．操作步驟2中培養基的裝量也是很重要的，建議裝量不要高於此值：500ml錐形瓶裝100ml培養基，250ml錐形瓶裝50ml培養基；3．在收穫菌體前半小時還可以在培養基中加入20mm的mgcl2，效果會更好一些；4．為保證細胞處於對數生長期，培養後的菌體的od值不要高於0.
6；5．製備感受態細胞時所有操作盡量保證在冰上操作；6．細胞轉化操作步驟6中也可以不必進行熱擊，冰浴後直接加入新鮮lb，簡化操作步驟，但轉化效率低於熱擊方法，適用於對轉化率要求不高的實驗。方法三：1、取1%大腸桿菌e.
coli接種於含2mllb培養基的試管中，37℃振盪培養過夜2、取0.1ml過夜培養物轉種於含10mllb培養基的三角瓶中，37℃振盪培養3h至od600=0.3ml離心管中，冰浴10min。
4、在4℃下以4000rpm離心5min，去上清液5、把菌體懸浮於15m1冰冷的0.1mcacl2溶液中，置冰上30min6、然後再在4℃下以4000rpm離心10min，去上清液7、將菌體懸浮於0.1mlcacl2溶液中，冰浴放置4-12hr備用。
方法四：（1）將1ml過夜培養的細菌（如dh52、tg1、tm101）接種於100ml2×yt培養於500ml燒瓶。於37℃刷烈振盪，通常≥200rpm培養的細菌密度約od550=0.
2～0.5(5×107cells/ml),需2～4h。（2）將培養物放於冰上致冷10min，於4℃離心細菌培養物，10000rpm離心10min。
（3）棄除上清，將細菌懸浮於原始培養體積的一半（約50ml）的50mmcacl2和10mmtris·hcl（ph8.0）無菌冷凍液體中。（4）將細菌懸浮放在冰上約5min，然後將懸浮物於4℃10000/rpm離心10min。
（5）棄上清，懸浮細菌於原始培養體積的1/15的50mmcacl和10mmtris·hcl（ph8.0）無菌冷凍中。此時的細胞是感受態細胞，即可用於轉化。
200μl分裝於無菌的1.5ml微量離心管中，貯存於-80℃冰箱中。方法五：
tsb法（也是本人熱衷的方法）1.藥品製備1mmg2+(1mmgso4和1mmgcl2等體積混合)，用0.22um濾膜超濾除菌。
tsb液（30ml/80ml菌液）（現配現用）：peg33503gtryptone0.3gyeastextract0.
15gnacl0.3g2.步驟：
（1）活化菌株（2）挑單菌落培養於5ml的液笨培養基中（3）取液體培養物50ul於80ml的液體培養基中進行擴大培養（4）370c培養3－4小時，od600在0.4－0.6（5）離心，去上清（6）加入20mltsb，重懸（7）離心，去上清（8）加入10mltsb，再加入15－20%的甘油，分裝儲存注，整個操作過程均應在冰上進行。
所用藥品均需滅菌。轉化程式（1）取出200μl感受態細胞慢慢使其溶化，並立即放於冰上，加入dna或連線反應混合物，dna量通常≤50mg。用手指彈打試管10次，使之混勻，然後放在冰上40～45min。
（2）將管放於42℃水浴中2min。（3）然後每管直接加入1.0ml2×yt培養基，倒置混勻，並於37℃培養8～12h，幹浴或水浴，不需振搖。
此期間使細菌生長並開始表達抗菌素。（4）每200μl轉化混合物分別於6個2×yt瓊脂培養板上補充相應抗生素，並含有x-gal（20mg/ml）、iptg（200mg/ml）。
為什麼製備大腸桿菌感受態細胞冰浴
7樓：阿魯巴星人
因為你在加入鈣離子之後，細胞很脆弱，需要低溫，這樣可以保護它。
質粒轉化實驗時為什麼要冰浴30min
8樓：匿名使用者
質粒轉化時先在冰中放置半小時後再42度熱激的原因： 熱激法：大腸桿菌在0℃cacl2低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形，轉化混合物中的dna形成抗dnase的羥基－鈣磷酸複合物粘附於細胞表面，經42℃短時間熱衝擊處理，促進細胞吸收dna複合物，在豐富培養基上生長數小時後，球狀細胞復原並**增殖。
在被轉化的細胞中，重組子基因得到表達，在選擇性培養基平板上可挑選所需的轉化子。所以，預先需要先在冰水中旋轉半小時。 也可以用電轉化法：
外加於細胞膜上的電場造成細胞膜的不穩定，形成電穿孔，不僅有利於離子和水進入細菌細胞，也有利於孔dna等大分子進入。同時dna在電場中形成的極性對於它運輸進細胞也是非常重要的。
9樓：科學普及交流
主要是為了控制反應條件。
保持溫度在0℃以下。
製作大腸桿菌感受態細胞為什麼離心用四千轉速
轉速低了離不下來，轉速高了到時候重選在轉化液裡很麻煩，所以要選取乙個合適的值。話說一半不用rpm來算，因為不同的離心機，力矩不一樣，不同轉速會有不同的離心力。所以一般用g，一般是1500 3000g都可以的。大腸桿菌感受態細胞製備為什麼要用cacl2處理細菌 ca離子沉聚在細胞膜表面會使得細胞膜呈一...
用氯化鈣怎樣製備新鮮的大腸桿菌感受態細胞
這屬於專業問題啦 下面的簡單方案是clhen等 1972 所用方法的變通方案，常用於成批製備感受態細菌，這些細菌可使每微克螺旋質粒dna產生5x106 2x107 個轉化菌落，這樣的轉化效率足以滿足所有在質粒中進行的常規轉殖的需要。該方法完全適用於大多數大腸桿菌菌株，並且比方案i快速，重複性更好。該...
把DNA加入感受態細胞時產生泡沫有什麼影響
沒有什麼影響,放心做下去吧 就是不要吹打,輕輕攪一下就好了 因為感受態比較脆弱，吹打會殺死它們。由於鈣等離子附著在細胞膜上，形成液晶狀態，所以細胞膜會變得很脆弱，在轉化復甦之前，都要輕輕地操作 影響感受態細胞製備的因素有哪些 1 細菌的生長狀態 實驗中應密切注視細菌的生長狀態和密度，盡量使用對數生長...