1樓：劉玲玲
1.挑取瓊脂培養皿上的單個菌落，移至3-10mllb培養液中，37℃150rpm培養過夜。
2.取1.5ml培養液移至eppendorf管內，12000rpm離心1分鐘，
內棄上清液容。
3.將細菌沉澱懸浮於100μl溶液（gte溶液）中，強烈振盪使之充分混勻。
4.加入200μl新鮮配置的溶液（naoh/sds溶液），蓋嚴管蓋輕輕顛倒離心管數次以混合內容物，置冰上5-10分鐘。
5.加入150μl溶液（5mol/l乙酸鈉，ph5.2），輕輕顛倒數次，使溶液充分混勻，冰上放置3-5分鐘。
6.10000rpm,4℃下離心10分鐘，將上清液轉移至另一離心管中。
7.加等體積的酚:氯仿，振盪混勻，10000rpm,4℃離心2min，將上清轉移至另一離心管中。
8.加兩倍體積無水乙醇沉澱雙鏈dna，充分混勻，室內放置2分鐘
9.10000rpm,4℃下離心10分鐘。
10.棄上清液，加1ml70％乙醇洗滌沉澱雙鏈dna，10000rmp，4℃下離心5分鐘，倒盡乙醇，吸乾管口殘留乙醇。
11.加40μg/ml rnase的te的緩衝液溶解dna。
質粒dna的大量提取和純化有哪些步驟
2樓：架構工程師
大提質復粒和小提質粒的基制
本原理是一樣的，都是通bai
過一定的方法（如du加鹼裂解）使在細菌zhi內大量擴增的質粒釋放dao出來，然後經過去蛋白去rna等一系列步驟純化dna，最終將dna提取出來。區別：
1.大提用於大量菌液的提取，100ml-500ml 均可，而小提用的菌液量很少，一般1.5-5ml。
2.一般試劑盒中大提比小提多了溶菌酶、異丙醇（**沉澱核酸）、含一定量peg的氯化物（**質粒dna）及乙酸銨等，其作用及目的都是有利於細菌的裂解和質粒的純化，所以大提的產物比小提的量多很多，而且純度很高。
3.小提一般用於質粒鑑定和對純度要求不是很高的實驗，大提用於質粒的大量提取和轉染等純度要求很高的實驗。
真核生物（如小鼠）的質粒如何提取，請寫下詳細步驟，謝謝
3樓：匿名使用者
對於小鼠來說，質粒只存在於線粒體中
1 裂解細胞
2 質粒dna與染色體dna的分離
3 純化
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小鼠cd40ig基因真核表達質粒的構建及鑑定
1 材料和方法
1.1 實驗動物 balb-c小鼠，6週齡, 雌性, 購自北京大學醫學院實驗動物部。
1.2 質粒、菌株、細胞株和主要試劑 質粒pegfp-n1、pgem-t載體質粒、e coli.dh5a（天根公司）。
低代次hek293細胞株（本元正陽）。admaxtm kit e試劑盒（microbix biosystems，inc.）。
taq酶、t4 dna連線酶（takara公司）。限制性核酸內切酶xmaⅰ、bgl ii、hind iii（biolabs）。trizol 試劑、lipofectamine 2000（invitrogen）。
逆轉錄試劑盒、pcr master mix（mbi）。質粒提取、膠純化試劑盒（qiagen）。dmem高糖培養基、胎牛血清、胰酶（gibco）。
引物合成由上海生工公司完成，基因測序由北京諾塞基因研究中心****完成。
1.3 構建小鼠cd40ig基因真核表達質粒
1.3.1 小鼠脾臟總rna的提取：將小鼠以頸椎脫臼法處死，取出脾臟，加入液氮研磨後，用trizol試劑提取總rna，方法按產品說明進行。
1.3.2 cd40、igg2a fc、gfp基因的製備：
以小鼠脾臟總rna為模板，oligo-dt為引物，rt-pcr合成cdna，再以此cdna為模板，用cd40和migg fc特異引物進行pcr擴增，另以pegfp-n1質粒為模板進行pcr擴增，引物及pcr反應條件見表1，分別獲得cd40、migg2a fc和gfp基因。
1.3.3 質粒pgem-igg的構建：
將igg fc的pcr產物與pgem-t質粒進行ta連線反應，即10μl pcr產物加2μl的pgem-t載體加10 u的t4連線酶，16 ℃過夜。取2μl的連線產物以氯化鈣法轉化大腸桿菌dh5α，用藍白斑方法挑選含氨苄青黴素抗性的白斑轉殖，在3 ml lb培養基（含氨苄青黴素100 μg/ml）中37 ℃、80 r/min振盪培養過夜，提取質粒pgem-igg並測序。
1.3.4 質粒p516-igg的構建：
用bgl ii分別消化pgem-igg和pdc516，產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳後進行膠純化。將igg片段和pdc516線性載體按7:
1的摩爾濃度比例加t4連線酶16 ℃過夜進行連線反應。取5μl連線產物轉化感受態大腸桿菌dh5α，用pdc516-f和migg-r引物組合進行菌落pcr篩選正向插入的重組子（見表2），將pcr陽性的重組子進行細菌培養，提取質粒並測序。
1.3.5 質粒p516-cd40-igg融合基因的構建：
用xma i分別消化cd40的pcr產物和p516-igg，將cd40片段和pdc516-igg 線性載體進行連線（方法同上）。轉化大腸桿菌dh5α後，用pdc516-f和cd40-r引物組合進行菌落pcr篩選（見表2），將陽性結果的重組子進行細菌培養，提取質粒並測序。
1.3.6 pdc516-cd40-igg-gfp質粒的構建：
用hind ⅲ分別消化gfp的pcr產物和pdc516-cd40-igg，將gfp片段和pdc516-cd-igg 線性載體進行連線反應（方法同上），用gfp-f和pdc516-r引物組合進行菌落pcr篩選正向插入的重組子（見表2），提取質粒並測序。
1.3.7 pdc516-cd40-igg-gfp質粒的大量製備：
按qiagen endofree plasmid purification試劑盒說明進行製備，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳證實（見圖2），紫外分光光度儀測od值，過濾除菌後-20 ℃儲存備用。
1.3.8 重組質粒轉染293細胞：
在6孔板中將2.0×105個細胞接種於2 ml含血清不含抗生素的dmem中，在5% co2、37 ℃培養箱中培養24 h，使細胞在轉染時鋪滿平板的60%～70%。用lipofectamine 2000轉染試劑介導重組質粒轉染，在無菌ep管中準備a、b兩種溶液。
a液：將4.0μg dna溶於250μl無血清dmem中，輕輕混勻；b液：
將10μl lipofectamine 2 000溶於250μl無血清培養液中，輕輕混勻，室溫孵育5 min。將a液和b液混合並混勻，室溫孵育20 min，以形成脂質體/dna複合物。換去6孔板中舊的培養液，重新加入2 ml含血清不含抗生素的dmem，逐滴加入500μl脂質體/dna複合物。
在5% co2、37 ℃培養箱中培養24 h後換液。
2 結果
2.1 獲得小鼠cd40胞外區、igg2a fc段及gfp基因 引物cd40-f和cd40-r經pcr擴增的小鼠cd40胞外區基因片段為572 bp；引物migg-f和migg-r經pcr擴增的小鼠igg2a fc段為700 bp；引物gfp-f和gfp-r經pcr擴增的gfp基因片段為765 bp。瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。
2.2 pdc516-cd40-igg-gfp真核表達質粒的成功構建
2.2.1 pdc516-igg的構建：
pgem-t載體為3 000 bp的質粒，構建的pgem-igg質粒為3 700 bp。pgem-t質粒的多轉殖位點上游110 bp處含有t7 primer序列，用t7+migg-r引物組合可擴增出約810 bp的片段，用t7 primer測序證實igg序列的正確性。將igg片段和pdc516線性載體進行連線反應，用pdc516-f測序證實igg插入序列的正確性（見圖3）。
2.2.2 pdc516-cd40-igg的構建：將cd40片段和pdc516-igg線性載體進行連線反應，用引物pdc516-f測序證實cd40插入序列的正確性。
2.2.3 pdc516-cd40-igg-gfp質粒的構建：
將gfp片段和pdc516-cd40-igg 線性載體進行連線反應，用pdc516-r測序證實gfp插入序列的正確性。cd40-igg-gfp含酶切位點的融合產物為2001bp，編碼667aa（見圖4）。
2.3 重組質粒在真核細胞內表達 pdc516-cd40-igg-gfp質粒抽提後在紫外分光光度計下檢測到od值為0.1257。
將該質粒用lipofectamine 2000轉染293細胞的第4天開始可見零星的細胞上有gfp表達，隨著時間的延長，gfp表達的細胞量逐漸增多，第7天左右在螢光顯微鏡下見大量的細胞有綠色螢光發生（見圖5）。
參考資料
4樓：匿名使用者
質粒是真bai核細胞細胞核外或du原核生物擬核區zhi外能夠進行自主複製dao的遺傳單位
版，包括真核生物的權細胞器（主要指線粒體和葉綠體）中和細菌細胞擬核區以外的環狀脫氧核糖核酸(dna)分子。現在習慣上用來專指細菌(大腸桿菌）、酵母菌和放線菌等生物中細胞核或擬核中的dna以外的dna分子。
小鼠沒有葉綠體，你可以直接參照小鼠線粒體的提取方法進行提取。
5樓：匿名使用者
小鼠有質粒麼?我記得好像沒有吧.
6樓：an娜公尺團之兔兔
老大 老鼠沒有質粒 質粒是有遺傳效應的環狀dna 存在於大腸桿菌等細菌中
質粒dna的提取方法
不知道樓主你說的對照 組，做的是陽性對照，還是陰性對照呢？如果這個不說清楚，是沒法回答你的問題。假設，你說的對照是陰性對照的話，首先第乙個，1，這個結果就是不對的，對照組出現菌落，說明你的抗生素失效了，實驗無效。2.的話說明你的轉化沒有成功，實驗操作跟試劑沒問題3.實驗成功，可以挑取單轉殖搖菌 假設...
關於質粒的問題,關於質粒轉化
第乙個問題你說的不對。補充說明 質粒一般是細菌細胞質基質中的小型環狀dna分子，應該無內顯子和外顯子的。如圖 第二個問題基因工程的產物是蛋白質。如果說基因工程匯入目的基因後市雜合子還算可以，因為目的基因是乙個，整合到染色體上的dna上的話，算是雜合子吧。這樣的遺傳遵循孟德爾遺傳規律。關於質粒轉化 5...
細菌質粒DNA和真核生物細胞器DNA的異同點
相同點 都可自來主複製。自 一旦消失以後，後代細胞中不再出現。他們的dna只佔染色體dna的一小部分。不同點 質粒dna結構簡單，一般都是較小的環狀dna分子，並不和其他物質一起構成一些複雜結構。質粒dna的功能比自體複製的細胞器更為多樣化，可一般並不是必需的，它們的消失並不影響宿主細菌的生存。許多...