1樓：匿名使用者
1、擴增曲線（如果做雙δct法）：
（1）擴增曲線必須是s型，有明顯的四個時期，且復孔的ct值盡量一致，相差不要超過0.5個ct值（上限是1個ct值）；
（2）同乙個基因在不同濃度的相同模板下擴增，其相差的ct值為相差濃度倍數的2次開方。當然這是理論值；另外陰性對照不能有擴增（40個迴圈以後出ct值屬正常現象，也可算作沒有擴增）。
2、溶解曲線：
（1）溶解曲線是判斷擴增產物是否單一的曲線，顧名思義，其跟模板（或其濃度）沒有關係，擴增什麼基因就應該有其相對應的溶解曲線；
（2）一般sybr法的目的基因在80~90℃之間；
（3）出現其他峰就該考慮是否為引物二聚體（一般為60~75℃之間）視引物長度而定，而基因組dna汙染的峰會在90℃以後。出現引物二聚體可能是引物設計、引物加量等原因所致；
（4）基因組dna那麼考慮設計跨內含子引物或者實驗之前做gdna的消除工作。而陰性對照有目的峰那可能就是模板汙染，注意實驗操作等避免模板汙染。
3、溶解曲線是為了驗證擴增產物特異性的，要是溶解曲線是單峰說明產物只有一條，結果較好；要是雙峰說明產物不特異，可能存在引物二聚體或非特異性擴增，有可能引物設計有問題。
2樓：匿名使用者
具體要看你做什麼實驗，模板和擴增的基因實怎樣的。
1、擴增曲線：一般來說如果你做雙δct法那麼你的擴增曲線必須是s型，有明顯的四個時期，且復孔的ct值盡量一致，相差不要超過0.5個ct值（上限是1個ct值）；同乙個基因在不同濃度的相同模板下擴增，其相差的ct值為相差濃度倍數的2次開方。
比如同一種cdna5倍濃度稀釋，那麼同一種基因擴增的前提下，5倍濃度模板的ct值會比1倍濃度模板的ct值提前2.3個迴圈左右，以此類推，當然這是理論值；另外陰性對照不能有擴增（40個迴圈以後出ct值屬正常現象，也可算作沒有擴增）。
2、溶解曲線：溶解曲線是判斷擴增產物是否單一的曲線，顧名思義，其跟模板（或其濃度）沒有關係，擴增什麼基因就應該有其相對應的溶解曲線，類似於電泳。那麼你擴增幾種基因就應該有幾種對應的峰（一般sybr法的目的基因在80~90℃之間），我說的是一般情況，這個跟擴增片段長短有關係。
出現其他峰就該考慮是否為引物二聚體（一般為60~75℃之間）視引物長度而定，而基因組dna汙染的峰會在90℃以後。出現引物二聚體可能是引物設計、引物加量等原因（也有可能是從加完反應液到上機開始pcr這之間的時間過長）所致；基因組dna那麼考慮設計跨內含子引物或者實驗之前做gdna的消除工作。而陰性對照有目的峰那可能就是模板汙染，注意實驗操作等避免模板汙染。
純手打，支援下。
3樓：匿名使用者
擴增曲線要是s形的，融解曲線要單峰。滿足這些條件結果才可靠
如何作qpcr的標準曲線
4樓：夏娃的夏天
作qpcr的標準曲線可以用pcr－elisa法作。
具體如下：
pcr－elisa法：
利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合；
再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色。
常規的pcr－elisa法只是定性實驗，加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測目的。
通過測定一系列已知組分的標準物質的某理化性質，從而得到該性質的數值所組成的曲線。
擴充套件資料：
實時螢光定量pcr技術，在pcr反應體系中加入螢光基團，利用螢光訊號積累實時監測整個pcr程序，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
檢測方法：
1、sybrgreenⅰ法：
在pcr反應體系中，加入過量sybr螢光染料，sybr螢光染料特異性地摻入dna雙鏈後，發射螢光訊號。
而不摻入鏈中的sybr染料分子不會發射任何螢光訊號，從而保證螢光訊號的增加與pcr產物的增加完全同步。
sybr定量pcr擴增螢光曲線圖、pcr產物熔解曲線圖（單一峰圖表明pcr擴增產物的單一性）。
2、taqman探針法：
探針完整時，報告基團發射的螢光訊號被淬滅基團吸收；
pcr擴增時，taq酶的5』-3』外切酶活性將探針酶切降解，使報告螢光基團和淬滅螢光基團分離，從而螢光監測系統可接收到螢光訊號。
即每擴增一條dna鏈，就有乙個螢光分子形成，實現了螢光訊號的累積與pcr產物的形成完全同步。
pcr反應的前15個迴圈的螢光訊號作為螢光本底訊號，螢光閾值的預設（預設）設定是3-15個迴圈的螢光訊號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10*sdcycle 3-15。
利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫座標代表起始拷貝數的對數，縱座標代ct值。因此，只要獲得未知樣品的ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
誰能具體解釋一下螢光定量pcr中溶解曲線的意思以及作用
5樓：匿名使用者
溶解曲線是判斷擴增產物是否單一的曲線，顧名思義，其跟模板（或其濃度）沒有關係，擴增什麼基因就應該有其相對應的溶解曲線，類似於電泳。那麼你擴增幾種基因就應該有幾種對應的峰（一般sybr法的目的基因在80~90℃之間），我說的是一般情況，這個跟擴增片段長短有關係。出現其他峰就該考慮是否為引物二聚體（一般為60~75℃之間）視引物長度而定，而基因組dna汙染的峰會在90℃以後。
出現引物二聚體可能是引物設計、引物加量等原因（也有可能是從加完反應液到上機開始pcr這之間的時間過長）所致；基因組dna那麼考慮設計跨內含子引物或者實驗之前做gdna的消除工作。而陰性對照有目的峰那可能就是模板汙染，注意實驗操作等避免模板汙染。
詳細請見我的回答
6樓：表詠蒿樂蓉
用syber
green方法做完pcr後，用來判斷產物是否相對專一。反應結束後，逐漸加溫。和syber
green分子結合的pcr產物隨溫度公升高逐漸變為單鏈，就不能在和syber
green結合。一般每加溫一度，讀一次訊號。當溫度到達pcr產物的tm時，產物解離一下增多。
曲線的橫座標是溫度，而縱座標是螢光訊號的變化！開始加熱，訊號變化不大，所以幾乎是平的，接近tm時，突然變化加大，所以出現峰值。再公升溫，產物全部解離，就又是一條直線了。
如果有非特異性產物，在加熱過程中就會出現一些比較矮，寬的峰。
怎麼理解螢光定量pcr的溶解曲線
7樓：匿名使用者
螢光定量pcr的溶解曲線理解：用syber green方法做完pcr後，用來判斷產物是否相對專一。應結束後，逐漸加溫。和syber
green分子結合的pcr產物隨溫度公升高逐漸變為單鏈，就不能在和syber
green結合。
一般每加溫一度，讀一次訊號。當溫度到達pcr產物的tm時，產物解離一下增多。曲線的橫座標是溫度，而縱座標是螢光訊號的變化，開始加熱，訊號變化不大，所以幾乎是平的。
接近tm時，突然變化加大，所以出現峰值。再公升溫，產物全部解離，就又是一條直線了。如果有非特異性產物，在加熱過程中就會出現一些比較矮，寬的峰。
8樓：匿名使用者
這個一般是用syby green作為螢光染料的時候需要做的工作！
因為syby green染料是非特異的染料，只要有擴增，染料就可以鑲嵌在雙鏈中發出螢光。我們做溶解曲線是為了觀察我們擴增發出螢光的片段是不是我們需要的產物。如果溶解曲線做出來只有單峰，且出鋒位置是你的退火溫度，那麼這個是你的產物發出的螢光，實驗結果有效。
如果出現多鋒或退火溫度不對，那麼這個實驗結果是不可信的！你需要再次調整！
求助，螢光定量pcr擴增曲線和溶解曲線
9樓：抹不掉呀
實時pcr產物的tm值大小一般會在80deg;上下，所以溶解曲線不必從40deg;開始，可以從65deg;開始進行溶解曲線繪製，另外在產物之前出現的小峰，同時也在陰性對照中出現了，應該是引物二聚體或者是非特異的擴增。
10樓：真莉莉畢田
通過你的描述目前還有很多資訊不實很了解：目的片段長度？pcr反應條件？
管家基因的溶解曲線怎麼樣？做的什麼實驗？是否將產物跑了電泳，條帶怎麼樣？
你可以將上述問題整理一下在一些專業性較強的生物論壇發帖子讓其他大神幫你分析一下。比如丁香園、生物秀等等。
出現怪異的溶解曲線大部分都是機器設定或者反應體系的問題，建議：
1、將擴增產物跑一下電泳，看一下目的條帶亮不亮2、一般定量pcr擴增後目的片段的峰在80~90℃之間，反應條件確認一下設定是否有問題
3、適當增加模板量或者減少引物濃度。
4、用的是哪個公司的酶？問一下這個公司的技術支援
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