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一、細胞培養的條件和要求
1.所有與細胞接觸的裝置、器材和溶液等，都必須保持絕對無菌，避免細胞外微生物的汙染。
目前最可靠和最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌。
如：玻璃製品、布類、金屬製品：6.8kg20min。
橡膠製品：3.6～4.5kg10min。
培養用液，如hanks液，水解乳蛋白：3.6～ 4.5kg10min。
實驗中染菌物品和動物屍體等：6.8 kg20min。
試管、吸管等，則可採用乾熱滅菌；
一切不適於加熱滅菌的液體，如人工合成培養液、小牛血清、胰蛋白酶等溶液，可採用過濾法除菌。
細胞培養中常用的消毒劑濃度及其使用場合
2.必須有足夠的營養**，而絕對不可有有害的物質，包括極微量的有害離子的摻入，為此必須注意器材的清洗和配液用水的質量。
細胞培養中對水的質量要求很高（見水處理）。
3.保證有適量的氧氣**。
細胞代謝需要有空氣，否則細胞死亡。在用培養瓶進行靜止培養，或用轉瓶進行旋轉培養時，只要培養的液體量不超過總容量的30％，通過與液面的空氣交換，可以保證細胞有足夠的氧氣。當用罐子深層培養時，則必須通氣，一般採用含5％co2的空氣，或根據需要將co2、n2、o2和空氣以不同比例混合，過量氧對細胞的生長也不利。
4.需隨時清除細胞代謝中產生的有害產物。
細胞在代謝過程中會產生大量代謝廢物，如co2、乳酸、氨、尿素、吲哚等，這些產物對細胞的生存有害，必須及時清除。在小量培養時，當培養基中酚紅指示劑顯示黃色，表示已有相當量乳酸產生，要及時更換新鮮的培養基。在大量培養時，則需隨時測定葡萄糖和乳酸等含量，並調節灌流速度，使代謝產物保持在無害水平下。
5.有良好的適於其生存的外界環境，包括溫度、ph、滲透壓和離子濃度等。
不同的細胞對ph的要求不同，一般來說適於細胞生長的ph在6.8～7.4，過高或過低均不利於細胞生長。
如上所述，細胞在代謝過程中會產生大量乳酸，使培養的ph下降。為了保持培養液的ph，常在培養液內加入各種緩衝系統，如na2hpo4/na2hpo4、nahco3/h2co3（co2）、tricineglycine，以及加緩衝劑hepes液（常用濃度為10～50mol/l）.
6.及時分種，保持合適的細胞密度（見細胞傳代）
二、細胞分離
1.人白細胞的分離。
常用於ifn－α和γ的製備。
它主要**於獻血者的靜脈血，也可來自手術時體外迴圈剩餘血，分娩時臍帶血，以及脾臟和扁桃體等組織。
2.人胚肌皮細胞的分離 。用於ifn-β的製備 。
三.體外培養細胞齡的計算
二倍體細胞齡以細胞群體倍增計算，以每個培養容器細胞群體細胞數為基礎，每增加一倍作為一世代，即1瓶細胞傳2瓶（1：2分種率）再長滿瓶為一世代；1瓶傳4瓶（1：4）為二世代；1瓶傳8瓶（1：
8）則為三世代。生產用細胞齡限制在細胞壽命期限的前2/3內。
傳代細胞系則以一定稀釋倍數進行傳代，每傳一次為一代。依據每個細胞系的實踐經驗資料，確保細胞質量及安全，確定生產使用細胞最後限制代次。
四.細胞鑑別試驗
新建細胞系或株、細胞庫和生產結束時的細胞應進行鑑別試驗，以確認為本細胞。可採用遺傳特徵、dna指紋圖譜、染色體標記、免疫學、hla和生化法（如同功酶）測定，任選其中一種方法。有簡便而能鑑別的方法亦可採用，但需經國家藥品檢定機構認可。
人二倍細胞株**於正常人胎肺或其他組織，主要用於培養病毒製備疫苗等。
1.細胞株的要求
人二倍體細胞株須按下列要求進行全面檢定。
（1）建立細胞株必須具備下列資料
建立細胞株所用的胎兒的胎齡和性別，終止妊娠原因。
建立細胞株所用的胎兒父母的年齡、職業及健康狀況（經醫生出具證明），胎兒父及母系三代應無明顯遺傳缺陷疾病歷史。在取胎兒組織前，應做出詳細調查。
原始組織種類，原始細胞培養的細胞數量與生長的狀況。
細胞培養方法、歷史、生長特徵和壽命的世代數。
細胞生長液的成分。
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（2）細胞株的檢定
染色體檢查
新 細胞株建株過程中，每8～12世代應作一次染色體檢查，一株細胞整個生命期內連續培養過程中，至少有4次染色體檢查結果。
細菌、真菌、支原體及病毒檢查
致腫瘤性檢查 ：每8～12世代，做一次細胞株異種移植試驗，觀察細胞株有無致瘤性質。
細胞株鑑別試驗
2.定義和術語
原代細胞**，包括猴腎、雞胚、地鼠腎、家兔腎、狗腎和鵪鶉胚，以及其他組織等。
原代細胞是用正常組織，以適當的消化液分散細胞進行培養。
原代細胞培養是以適當的消化液消化正常動物組織以分散細胞，培養成單層細胞直接用於生產，只限於原代或少數幾代（一般1～5代）內，用於生產的細胞以生物學性狀不發生改變為原則。
細胞生長（營養）液：是提供細胞生長繁殖的培養液，可含少量動物血清，多為小牛或胎牛血清（常用10％）。
細胞維持液：是提供細胞維持正常新陳代謝的培養液，不含動物血清（或少量，常用2～5％），只維持細胞正常生存，可滿足病毒複製等。
3.雞胚細胞的分離，在ifn研究中常需要它來製備測定ifn活性的水泡性口炎病毒（vsv），以及用以滴定病毒。
4.常用消化液的配製方法 ：
（1）1％胰蛋白酶溶液的配製：
①取胰蛋白酶10g（一般採用活力為1：250的胰蛋白酶，即1份胰蛋白酶能解離250份酪蛋白）；
②用少量hanks液先將胰蛋白酶粉末調成糊狀；③補足hanks液至1l，振搖混勻，置4℃冰箱內過夜；
④用g6玻璃濾器或用分子濾膜過濾除菌；
⑤分裝小瓶，低溫冰箱冰凍儲存備用，同時取樣作無菌試驗；
⑥使用時用hanks液稀釋成0.25％或0.125％，並用nahco3調至ph7.0或偏鹼。
（2）0.02％edta溶液的配製：
①稱取edta0.2g；
②用1lhanks液溶解；
③15～20min高壓滅菌；
④分裝小瓶，4℃冰箱儲存備用。
（3）胰蛋白酶－檸檬酸鹽配方：
胰蛋白酶（1：250）2.5g；
檸檬三鈉2.96g；
氯化鈉6.15g；
酚紅（1％）1.5ml；
無離子水加至1l。
用naoh調至ph7.8（約1mol/l naoh 2ml），用濾紙粗濾，用g6玻璃漏斗過濾，分裝小瓶，低溫冰凍儲存，並作無菌試驗
（4）胰蛋白酶－edta溶液的配製：
1份0.25％胰蛋白酶－檸檬酸鹽；
4份0.02％edta溶液。
五、細胞計數
1.計數方法
（1）先用培養基將細胞懸液作適當稀釋。
（2）用吸管吸取少量細胞懸液，滴於計數板上蓋玻片一端，讓液體自動進入蓋片下間隙，勿留氣泡。
（3）鏡下觀察並計算出四角大格內的細胞數，計數時注意只計上線和右線的細胞。
按下式計算細胞濃度：
細胞數/ml＝4大格中細胞總數÷4×10000×稀釋倍數
2.區別細胞死活的方法
（1）台盼藍
（2）苯胺黑
（3）結晶紫－檸檬酸
六、細胞傳代
1.懸浮細胞地傳代 ：
懸浮細胞的傳代比較容易，只要加上一倍或幾倍的生長液，然後分種幾隻培養瓶即可。
2.貼壁細胞的傳代：
貼壁細胞需經消化後分種 。
七、細胞的凍存和復甦
1.細胞的凍存
降溫步驟：
2．細胞的復甦
復甦時總的要求是快融
八、細胞培養用水處理
1.水處理裝置
細胞培養對水質的要求很高，不僅不能有微生物汙染，而且也不能有有害的離子存在，一般均採用蒸餾和離子交換相結合的方法，最後再通過除菌滅菌。一般要求水的電阻值大於18mω
2.純水離子交換法製造原理
所謂純水離子交換和除菌器是將原水中的鹽類，游離酸，鹼，微生物及其他雜物全部除去的處理方法。
用此法製造的純水要比蒸餾水純得多。
（1）陽離子交換樹脂：
r(-so3h)2+ca(hco3)2 r(-so3)ca+2h2co3
r(-so3h )2+ nacl r(-so3)na+hcl
r(-so3h )2 + na2so4 r(-so3na)2+h2so4
（2）陰離子交換樹脂：
r≡nhoh+hcl r≡nhcl+h2o
r≡nhoh+h2co3 r≡nh(hco3)+h2o
r(≡nhoh)2+h2so4 r(≡nh)2so4+2h2o
3.裝柱步驟
4.離子交換樹脂再生
無論是新處理的樹脂還是使用過的樹脂，都要進行再生 。
體外細胞培養需要什麼條件
3樓：北京索萊寶科技****
1.實驗室
細胞培養是一種無菌操作技術,要求工作環境和條件必須保證無微生物汙染和不受 其它有害因素的影響.細胞培養室和設計原則是防止微生物汙染和有害因素影響,要求工作環境清潔,空氣清新,乾燥和無煙塵.細胞培養室的設計原則一般是無菌操作區設在室內較少走動的內側,常規操作和封閉培養於一室,而洗刷消毒在另一室.
2.常用設施及裝置
⑴超淨工作台：也稱淨化工作台,分為側流式,直流式和外流式三大類.
⑵無菌操作間：一般由更衣間,緩衝間和操作間三部分組成.操作間放置淨化工作台及二氧化碳培養箱,離心機,倒置顯微鏡等.緩衝間可放置電冰箱,冷藏器及消毒好的無菌物品等.
⑶操作間：普通培養箱,離心機,水浴鍋,定時鐘,普通天平及日常分析處理物
⑷洗刷消毒間：烤箱,消毒鍋,蒸餾水處理器及酸缸等.
⑸分析間：顯微鏡,計算機及印表機等.
3.培養器皿
常用細胞培養器皿有培養瓶,培養板,培養皿等.常準備量是使用量的三倍.器皿應選擇透明度好,無毒,利於細胞粘附和生長的材料,常用一次性聚苯乙烯材料製品或中性硬度玻璃製品.
常用的器皿有下面幾種.
⑴液體儲存瓶：用於儲存各種配製好的培養液,血清等液體,常用規格有500ml,250ml,100ml等幾種.
⑵培養瓶：根據培養細胞種類要求不同培養瓶的形態各異,用於細胞傳代培養的細胞要求瓶壁厚簿均勻,便於細胞貼壁生長和觀察,瓶口要大小一致,口徑一般不小於1cm,允許吸管伸入瓶內任何部位,規格有200ml,100ml,50ml,25ml,10ml等幾種.
⑶培養皿：用於開放式培養及其它用途.分直徑30mm,60mm,120mm等幾種.
⑷吸管：常用的有長吸管和短吸管兩類,長吸管也稱刻度吸管.其改良後管上部有球型刻度稱改良吸管,刻度吸管用於移動液體.
常用1ml和10ml兩種.短吸管也叫滴管,分彎頭和直頭兩種.
⑸離心管：離心管是細胞培養中使用最廣泛的器皿,根據用途不同形態各樣,常用於細胞培養的離心管有大腹式尖底離心管和普通尖底離心管兩類.前者分別為50ml,30ml,15ml；後者則多為10ml和5ml.
⑹其它：如三角燒瓶,燒杯,量筒,漏斗,注射器等.
4.細胞培養溫度
維持培養細胞旺盛生長,必須有恆定而適宜的溫度.不同種類的細胞對培養溫度要求也不同.人體細胞培養的標準溫度為36.
5℃±0.5℃,偏離這一溫度範圍,細胞的正常代謝會受到影響,甚至死亡.培養細胞對低溫的耐受力較對高溫強,溫度上公升不超過39℃時,細胞代謝與溫度成正比；人體細胞在39-40℃1小時,即能受到一定損傷,但仍有可能恢復；在40-41℃1小時,細胞會普遍受到損傷,僅小半數有可能恢復；41-42℃1小時,細胞受到嚴重損傷,大部分細胞死亡,個別細胞仍有恢復可能；當溫度在43℃以上1小時,細胞全部死亡.
相反,溫度不低於0℃時,對細胞代謝雖有影響,但並無傷害作用；把細胞放入25-35℃時,細胞仍能生存和生長,但速度減慢；放在4℃數小時後,再回到37℃培養,細胞仍能繼續生長.細胞代謝隨溫度降低而減慢.當溫度降至冰點以下時,細胞可因胞質結冰受損而死亡.
但是,如果向培養液中加入一定量的冷凍保護劑（二甲亞碸或甘油）,可在深低溫下如-80℃或-196℃（液氮）長期儲存.
5.合適的氣體環境
氣體是哺乳動物細胞培養生存必需條件之一,所需氣體主要有氧氣和二氧化碳.氧氣參與三羧酸迴圈,產生供給細胞生長增殖的能量和合成細胞生長所需用的各種成分.開放培養時一般把細胞置於95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環境中.
二氧化碳既是細胞代謝產物,也是細胞生長繁殖所需成分,它在細胞培養中的主要作用在於維持培養基的ph值.大多數細胞的適宜ph為7.2-7.
4,偏離這一範圍對細胞培養將產生有害的影響.但細胞耐酸性比耐鹼性大一些,在偏酸環境中更利於細胞生長.但有一些細胞也喜歡偏鹼環境中生長,如成纖維細胞最適合ph是7.
4-7.6.每種細胞都有其最適ph值.
細胞培養1的血清培養液有什麼用在細胞培養液中加入血清的有哪些作用
1 提供基本營養物質 氨基酸 維生素 無機物 脂類物質 核酸衍生物等，是細胞生長必須的物質。2 提供激素和各種生長因子，生長因子如成纖維細胞生長因子 表皮生長因子 血小板生長因子等。3 提供結合蛋白 結合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質，如白蛋白攜帶維生素 脂肪 以及激素等，轉鐵蛋白攜帶鐵。結合蛋白...
細胞培養，溶氧，kla值是多少
a 曲線ab段是隨著營養液中k 濃度增加，k 吸收速率增加，限制性因素是k 濃度，但能量充足，而且細胞膜上k 載體數量未達到飽和，bc段可能是載體數量是有限的，故a正確 b 曲線cd段的形成是由於培養液濃度過大，導致細胞失水，細胞代謝減弱，為主動運輸提供的能力減少導致 故b錯誤 c e點表明植物根系...
細胞培養中培養基為什麼要用pbs洗
pbs緩衝液ph值在7.2 7.4之間，是細胞最適合的ph值範圍。且在酸鹼微量的刺激下ph值基本不會發生變化。而培養細胞使用過的培養基ph值會發生變化，對細胞有傷害，細胞經過pbs緩衝液清洗會去除廢棄的培養基，而保持細胞能在適合的ph值範圍之內，良好生活。從而再換新的培養基使細胞繼續增殖。丁香園為什...