1樓：匿名使用者
簡單的說一下：
擴增目的基因，比如通過pcr的方法。
pcr擴增的序列可以通過酶切或者topo ta的方法插入到載體質粒。
轉染大腸桿菌
篩選陽性轉殖一般常採用藍白轉殖方法，就是在載體上，序列的插入位置本來是乙個完整編碼β-gal這個酶的序列，如果不被破壞，產生的酶可以降解細菌培養盤上的底物，形成藍色產物。如果有目的序列插入，這個酶就不能表達，形成的轉殖就是白色的。
挑取陽性轉殖，測序確認無變異和方向後，擴增質粒，提純質粒。
基因轉殖的基本步驟有哪些
2樓：阿樓愛吃肉
基因轉殖的基本步驟流程如下：
一、目的dn**段的獲得：
dna轉殖的第一步是獲得包含目的基因在內的一群dna分子，這些dna分子或來自於目的生物基因組dna或來自目的細胞mrna逆轉錄合成的雙鏈 cdna分子。
由於基因組dna較大，不利於轉殖，因此有必要將其處理成適合轉殖的dna小片段，常用的方法有機械切割和核酸限制性內切酶消化。若是基因序列已知而且比較小就可用人工化學直接合成。如果基因的兩端部分序列已知，根據已知序列設計引物，從基因組dna 或cdna中通過pcr技術可以獲得目的基因。
二、載體的選擇：
基因轉殖常用的載體有：質粒載體、噬菌體載體、柯斯質粒載體、單鏈dna噬菌體載體、噬粒載體及酵母人工染色體等。從總體上講，根據載體的使用目的，載體可以分為轉殖載體、表達載體、測序載體、穿梭載體等。
三、體外重組：
體外重組即體外將目的片斷和載體分子連線的過程。大多數核酸限制性內切酶能夠切割dna分子形成有黏性末端，用同一種酶或同尾酶切割適當載體的多轉殖位點便可獲得相同的黏性末端，黏性末端彼此退火，通過t4 dna連線酶的作用便可形成重組體，此為黏末端連線。
當目的dn**斷為平端，可以直接與帶有平端載體相連，此為平末端連線，但連線效率比黏端相連差些。有時為了不同的轉殖目的，如將平端dna分子插入到帶有黏末端的表達載體實現表達時，則要將平端dna分子通過一些修飾；
如同聚物加尾，加銜接物或人工接頭，pcr法引入酶切位點等，可以獲得相應的黏末端，然後進行連線，此為修飾黏末端連線。
四、匯入受體細胞：
載體dna分子上具有能被原核宿主細胞識別的複製起始位點，因此可以在原核細胞如大腸桿菌中複製，重組載體中的目的基因隨同載體一起被擴增，最終獲得大量同一的重組dna分子。
五、重組子的篩選：
從不同的重組dna分子獲得的轉化子中鑑定出含有目的基因的轉化子即陽性轉殖的過程就是篩選。發展起來的成熟篩選方法如下：
（1）插入失活法：外源dn**段插入到位於篩選標記基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多轉殖位點後，會造成標記基因失活，表現出轉化子相應的抗生素抗性消失或轉化子顏色改變，通過這些可以初步鑑定出轉化子是重組子或非重組子。常用的是β-半乳糖苷酶顯色法即藍白篩選法（白色菌落是重組質粒）。
（2）pcr篩選和限制酶酶切法：提取轉化子中的重組dna分子作模板，根據目的基因已知的兩端序列設計特異引物，通過pcr技術篩選陽性轉殖。pcr法篩選出的陽性轉殖，用限制性內切酶酶切法進一步鑑定插入片段的大小。
（3）核酸分子雜交法：製備目的基因特異的核酸探針，通過核酸分子雜交法從眾多的轉化子中篩選目的轉殖。目的基因特異的核酸探針可以是已獲得的部分目的基因片段,或目的基因表達蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物種的同源基因。
（4）免疫學篩選法：獲得目的基因表達的蛋白抗體，就可以採用免疫學篩選法獲得目的基因轉殖。這些抗體即可是從生物本身純化出目的基因表達蛋白抗體，也可從目的基因部分orf片段轉殖在表達載體中獲得表達蛋白的抗體。
3樓：抗壓吧務隊團
步驟如下：
1、目的dn**段的獲得
dna轉殖的第一步是獲得包含目的基因在內的一群dna分子，這些dna分子或來自於目的生物基因組dna或來自目的細胞mrna逆轉錄合成的雙鏈 cdna分子。
由於基因組dna較大，不利於轉殖，因此有必要將其處理成適合轉殖的dna小片段，常用的方法有機械切割和核酸限制性內切酶消化。
若是基因序列已知而且比較小就可用人工化學直接合成。如果基因的兩端部分序列已知，根據已知序列設計引物，從基因組dna 或cdna中通過pcr技術可以獲得目的基因。
2、載體的選擇
基因工程的載體應具有一些基本的性質：
（1）在宿主細胞中有獨立的複製和表達的能力，這樣才能使外源重組的dn**段得以擴增。
（2）分子量盡可能小，以利於在宿主細胞中有較多的拷貝，便於結合更大的外源dn**段。同時在實驗操作中也不易被機械剪下而破壞。
（3）載體分子中最好具有兩個以上的容易檢測的遺傳標記（如抗藥性標記基因），以賦予宿主細胞的不同表型特徵（如對抗生素的抗性）。
（4）載體本身最好具有盡可能多的限制酶單一切點，為避開外源dn**段中限制酶位點的干擾提供更大的選擇範圍。若載體上的單一酶切位點是位於檢測表型的標記基因之內可造成插入失活效應，則更有利於重組子的篩選。
dna轉殖常用的載體有：質粒載），噬菌體載體，柯斯質粒載體，單鏈dna噬菌體載體，噬粒載體及酵母人工染色體等。從總體上講，根據載體的使用目的，載體可以分為轉殖載體，表達載體，測序載體，穿梭載體等。
3、體外重組
體外重組即體外將目的片斷和載體分子連線的過程。大多數核酸限制性內切酶能夠切割dna分子形成有黏性末端，用同一種酶或同尾酶切割適當載體的多轉殖位點便可獲得相同的黏性末端，黏性末端彼此退火，通過t4 dna連線酶的作用便可形成重組體，此為黏末端連線。
當目的dn**斷為平端，可以直接與帶有平端載體相連，此為平末端連線，但連線效率比黏端相連差些。
有時為了不同的轉殖目的，如將平端dna分子插入到帶有黏末端的表達載體實現表達時，則要將平端dna分子通過一些修飾，如同聚物加尾，加銜接物或人工接頭，pcr法引入酶切位點等，可以獲得相應的黏末端，然後進行連線，此為修飾黏末端連線。
4、匯入受體細胞
載體dna分子上具有能被原核宿主細胞識別的複製起始位點，因此可以在原核細胞如大腸桿菌中複製，重組載體中的目的基因隨同載體一起被擴增，最終獲得大量同一的重組dna分子。
將外源重組dna分子匯入原核宿主細胞的方法有轉化，轉染，轉導。重組質粒通過轉化技術可以匯入到宿主細胞中，同樣重組噬菌體dna可以通過轉染技術匯入。
轉染效率不高，因此將重組噬菌體 dna或柯斯質粒體外包裝成有浸染性的噬菌體顆粒，借助這些噬菌體顆粒將重組dna分子匯入到宿主細胞轉導技術，這種轉導技術的匯入效率要比轉染的匯入效率高。
5、重組子的篩選
從不同的重組dna分子獲得的轉化子中鑑定出含有目的基因的轉化子即陽性轉殖的過程就是篩選。發展起來的成熟篩選方法如下：
（一）插入失活法
外源dn**段插入到位於篩選標記基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多轉殖位點後，會造成標記基因失活，表現出轉化子相應的抗生素抗性消失或轉化子顏色改變，通過這些可以初步鑑定出轉化子是重組子或非重組子。常用的是β-半乳糖苷酶顯色法即藍白篩選法。
（二）pcr篩選和限制酶酶切法
提取轉化子中的重組dna分子作模板，根據目的基因已知的兩端序列設計特異引物，通過pcr技術篩選陽性轉殖。pcr法篩選出的陽性轉殖，用限制性內切酶酶切法進一步鑑定插入片段的大小。
（三）核酸分子雜交法
製備目的基因特異的核酸探針，通過核酸分子雜交法從眾多的轉化子中篩選目的轉殖。目的基因特異的核酸探針可以是已獲得的部分目的基因片段,或目的基因表達蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物種的同源基因。
（四）免疫學篩選法
獲得目的基因表達的蛋白抗體，就可以採用免疫學篩選法獲得目的基因轉殖。這些抗體即可是從生物本身純化出目的基因表達蛋白抗體，也可從目的基因部分orf片段轉殖在表達載體中獲得表達蛋白的抗體。
上述方法獲得的陽性轉殖最後要進行測序分析，以最終確認目的基因。
4樓：莫彷徨
選擇目的基因,並設計相應引物；
用引物pcr擴增目的基因片段；
選擇合適（抗性標記、酶切位點等）的轉殖載體（為了保真擴增）,並將pcr片段連線入轉殖載體中；（一般用taq酶的pcr產物在末尾會自帶乙個a,可在solution 1作用下與兩端各帶乙個t的線性t載體直接相連）
將連線產物轉化入感受態大腸桿菌,使之在含有抗生素的培養基上生長擴增；
從大腸桿菌中提取質粒（即前面的連線產物）,酶切鑑定和測序鑑定均無誤後將目的基因片段切下並與新的表達載體連線,然後再次轉化入大腸桿菌中擴增,再提質粒,即得到想要的目的基因片段轉殖.
5樓：忻璧計清馨
原發布者:hanwu980
1總rna提取(1)液氮研磨或冰上勻漿實驗材料；先將1mltrizol加到離心管中待用(2)將研磨好的樣品加到離心管中混勻，室溫放置5min；開啟離心機預冷(3)加200µl氯仿，振盪15sec，室溫放置3min，分層；(4)4oc，12,000g，離心15min；(5)取上清，加500μl異丙醇，混勻，室溫放置10min；(6)4oc，12,000g，離心10min；(7)棄上清，加1ml75%乙醇，漂浮洗滌沉澱，振盪充分；再用100%乙醇清洗(8)4oc，7,500g，離心5min；(9)棄上清，離心，用槍吸取多餘液體，放在超淨台裡乾燥後，加50μldepc水，－80oc儲存。此操作中所用到的器皿均需經過depc滅活rna酶處理。提取的總rna需經rna電泳檢測質量，並用紫外分光光度計測定濃度。
od260值為核酸的吸收值，od280值為蛋白的吸收值，od260/280值在1.8-2.0間一般說明該核酸蛋白含量在允許的範圍內，可正常使用；此外還有od230值為多醣和酚類的吸收值，比較乾淨的核酸od260/230值能達到2.
2左右。rna濃度計算公式：總rna濃度（µg/ml）=a260×稀釋倍數×40。
2反轉錄/cdna第一鏈的合成純化rna以去除基因組dna，操作按takara公司的primescriptrtreagentwithgdnaeraser(perfectrealtime)說明書進行。其體系為：條件為：
42oc，2min；rna純化後，即可進行反轉錄。其體系為：5×primescriptbuffer2（forrealtime）4μl操作條件為：
(1)37oc放置15min；(2)85oc，5sec；(3)4oc儲存。**cr按takara公司的premixtaqversio
基因轉殖的常用方法有哪幾種,基因轉殖的方法主要有哪幾種，簡述各種方法的原理和用途
根據已知探針轉殖基因 這也是基因轉殖的一種較直接的方法。首先將探針作放射性或非放射性標記,再將其與用不同內切酶處理的基因組dna雜交,最後將所識別的片段從膠中切下來，轉殖到特定的載體 質粒 噬菌體或病毒 中作序列測定或功能分析。這種方法不但可以將基因轉殖出來,還能同時觀察該基因在基因組中的拷貝數。但...
護膚有哪些步驟，護膚步驟都有哪些步驟？
護膚真的是女生一生的事業，寶寶們一定要做好護膚 正確的護膚步驟是清潔臉部後，根據護膚品的分子大小，先用小分子再用大分子，這樣就能把水分鎖住在 上，達到較好的護膚效果。護膚步驟都有哪些步驟？愛美之心，人皆有之。特別是對於青春靚麗的愛美人士們，對護膚問題真是不敢有絲毫懈怠，每天花費時間來保養自己的肌膚，...
現在發現的肥胖基因有哪些,有肥胖基因。是不是注定是胖子。
現在發現11個有關肥胖的基因，主要有fto gnb3 mc3r pomc adipoq mc4r pcsk1 fam71f1 pparg apoa2 apoa5。也許以後還會發現 現在發現的肥胖基因有哪些？現在發現11個有關肥胖的基因，主要有fto gnb3 mc3r pomc adipoq mc4...